Impaired protamination and sperm DNA damage in a Nellore bull with high percentages of morphological sperm defects in comparison to normospermic bulls / Deficiências de protaminação e danos de DNA no sêmen de um touro Nelore com elevada porcentagem de patologias espermáticas em comparação a touros normospérmicos

The routine semen evaluation assessing sperm concentration, motility and morphology, does not identify subtle defects in sperm chromatin architecture. Bulls appear to have stable chromatin, with low levels of DNA fragmentation. However, the nature of fragmentation and its impact on fertility remain unclear and there are no detailed reports characterizing the DNA organization and damage in this species. The intensive genetic selection, the use of artificial insemination and in vitro embryo production associated to the cryopreservation process can contribute to the chromatin damage and highlights the importance of sperm DNA integrity for the success of these technologies. Frozen-thawed semen samples from three ejaculates from a Nellore bull showed high levels of morphological sperm abnormalities (55.8±5.1%), and were selected for complementary tests. Damage of acrosomal (76.9±8.9%) and plasma membranes (75.7±9.3%) as well as sperm DNA strand breaks (13.8±9.5%) and protamination deficiency (3.7±0.6%) were significantly higher compared to the values measured in the semen of five Nellore bulls with normospermia (24.3±3.3%; 24.5±6.1%; 0.6±0.5%; 0.4±0.6% for acrosome, plasma membrane, DNA breaks and protamine deficiency, respectively) (P<0.05). Motility and percentage of spermatozoa with low mitochondrial potential showed no differences between groups. This study shows how routine semen analyses (in this case morphology) may point to the length and complexity of sperm cell damage emphasizing the importance of sperm function testing.(AU)

O exame de rotina de sêmen, o qual avalia a concentração de espermatozoides, a motilidade e a morfologia, pode não identificar defeitos sutis na arquitetura da cromatina de espermatozoides. Os touros parecem ter cromatina estável com baixos níveis de fragmentação do DNA. No entanto, a natureza da fragmentação e o seu impacto sobre a fertilidade ainda não estão claros e não há relatos que caracterizam a organização do DNA e os danos nessa espécie com mais detalhes. A seleção genética intensiva e o uso da inseminação artificial e da produção in vitro de embriões, além do processo de criopreservação, podem contribuir para o dano da cromatina, e sabe-se a importância da integridade do DNA espermático para o sucesso dessas tecnologias. Amostras de sêmen de três ejaculados de um touro Nelore com altos níveis de alterações morfológicas (55,8±5,1%) foram selecionadas para realização de exames complementares. Os danos de acrossoma (76,9±8,9%) e das membranas plasmáticas (75,7±9,3%), bem como quebras de fita de DNA de espermatozoides (13,8±9,5) e deficiência de protamina (3,7±0,6) foram significativamente maiores em comparação aos valores avaliados no sêmen de cinco touros Nelore com normospermia (24,3±3,3%; 24,5±6,1%; 0,6±0,5%; 0,4±0,6% para acrossoma, membrana plasmática, quebras de DNA e deficiência de protamina, respectivamente) (p<0,05). Motilidade e porcentagem de espermatozoides com baixo potencial mitocondrial não diferiram estatisticamente. Essas avaliações mostram que análises de sêmen de rotina (neste caso, morfologia) podem apontar para a extensão e a complexidade dos danos na célula espermática, o que indica que a deficiência de protamina e os danos no DNA podem ocorrer simultaneamente a defeitos morfológicos. Tal ocorrência enfatiza a importância das análises de sêmen clássicas e dos testes complementares.(AU)

Efeito da utilização de diferentes diluidores para a produção in vitro de embriões bovinos / Effect of different bovine semen extenders on in vitro development of bovine embryos

Objetivou-se avaliar as características morfológica e funcional do sêmen bovino congelado comparando-se a eficácia de dois diferentes diluidores. O ejaculado de quatro touros foi dividido em duas partes iguais, uma submetida ao diluidor Tris e gema de ovo (A) e outra ao diluidor à base de lecitina de soja (Andromed®) (B). No experimento I, cinco palhetas dos diluidores A e B de cada touro foram descongeladas e avaliadas quanto à motilidade, vigor, concentração, morfologia espermática e teste de termor-resistência lento. Foram feitas, ainda, avaliação da integridade de membranas, por meio da associação das sondas iodeto de propídio, isotiocionato de fluoresceína - Pisum sativum e carbocianina catiônica lipofílica, e avaliação funcional da membrana plasmática com teste hiposmótico. A avaliação da integridade da cromatina foi realizada pelo método de coloração com laranja de acridina. No experimento II, o sêmen com os diferentes diluidores foi utilizado na fecundação in vitro, sendo observadas taxas de clivagem e desenvolvimento embrionário in vitro. Em relação aos resultados obtidos, apenas a porcentagem de espermatozoides no sêmen congelado foi discretamente maior com o diluidor A, concluindo-se que o diluidor composto por lecitina de soja pode substituir o composto por Tris e gema de ovo, respeitando-se as variações individuais de cada touro utilizado no presente experimento.

The goal of this study was to evaluate the protective effect of egg yolk compared with a soybean lecithin-based extender on morphologic and functional characteristics of frozen bovine semen. The ejaculate of four bulls was divided into two equal parts, one diluted with egg-yolk-Tris extender (A) and the other with a soy-lecithin based extender (Andromed®) (B). In experiment I, five straws of extender A and B from each bull were thawed and assessed regarding motility (subjective and computerized analysis), vigor, concentration, sperm morphology and slow thermoresistance (STR), evaluation of membrane integrity through association of propidium iodite probes (PI), fluorescein isotiocianate - Pisum sativum (FITC-PSA) and lipophilic cationic carbocyanine (JC-1) and functional evaluation of the plasmatic membrane through Hyposmotic Swelling Test (HOST). An evaluation of chromatin integrity was performed with the acridine orange staining procedure. In experiment II, the frozen semen with different extenders was used for in vitro fertilization (IVF), analyzing cleavage rates and in vitro embryo development. No statistical difference between extenders was identified, suggesting that the soy lecithin extender may substitute egg-yolk-Tris extender, considering the individual variations of each bull used in this experiment.

Perfil em SDS-PAGE das proteínas do plasma seminal e sua relaçäo com a congelabilidade do sêmen de touros doadores da raça gir / SDS-PAGE seminal plasma proteins pattern and its correlation with gir breed semen freezability

Foram utilizados dez animais doadores de sêmen em nível de Central de Inseminaçäo Artificial, da raça Gir, divididos em dois grupos, de acordo com o grau de congelabilidade do sêmen de cada animal. Os animais com sêmen de alta congelabilidade foram aqueles cuja porcentagem de ejaculados viáveis pós-descongelaçäo foi superior a 80 por cento. O grupo de baixa congelabilidade tinha animais com porcentagem menor que 50 por cento de ejaculados viáveis pós-descongelaçäo. Os critérios de avaliaçäo da viabilidade do sêmen e seleçäo dos animais foram definidos pelo controle de qualidade do Departamento de Produçäo da Central de Inseminaçäo Artificial. Foram feitas quatro coletas semanais consecutivas, sendo que obtiveram-se as amostras de plasma seminal por centrifugaçäo a 1.500 g por 15 a 20 minutos a 4ºC, momentos após a coleta do sêmen em vagina artificial. O plasma seminal foi dialisado em membrana de celulose, em tampäo Tris-Glicina pH-7,4 por 24 horas a 4ºC, em agitaçäo lenta e constante. As amostras foram padronizadas em 1,0 mg/ml de proteína total, por diluiçäo em tampäo Tris-HCl 62mM pH-6,2 mais 20 por cento de glicerol e 4 por cento de SDS. Através de eletroforese do tipo SDS-PAGE, foram feitas as corridas em gel a 13 por cento. A corrida foi feita com a constante de 25 mA, por um período de 5 horas. A coloraçäo do gel foi feita por Coomassie Brilliant Blue. Pelos resultados obtidos, verificou-se que existe uma banda no grupo de alta congelabilidade, cujo fragmento polipeptídico desta proteína tem Mr (mobilidade relativa) 20,3 e PM (peso molecular) aproximado de 61.800 Da. Esta banda nao foi detectada nas amostras do grupo de baixa congelabilidade, o que sugere ser um possível marcador bioquímico quanto ao potencial de criopreservaçäo do sêmen de bovinos

Polimorfismo da transferrina e albumina e as associaçöes com precocidade sexual em bovinos da raça Nelore doadores de sêmen / Transferrin and albumin polimorphism and its correlation with sexual maturity in bulls

O presente estudo utilizou 16 animais Bos taurus indicus da raça Nelore doadores de sêmen. Estes animais foram divididos em grupos de acordo com a idade em que o sêmen congelou pela primeira vez. O grupo I, considerado precoce, apresentou animais com sêmen passível de congelaçäo com idade inferior a 20 meses. O grupo II, composto por animais que tiveram o sêmen congelado com idade entre 21 e 26 meses. E o grupo III, tido como tardio, composto por animais com sêmen congelável com idade superior a 27 meses. Para análise dos padröes eletroforéticos da transferrina e albumina, amostras de sangue foram colhidas em tubos heparinizados e submetidos a centrifugaçäo de 2.500 G por 15 minutos para separaçäo do plasma sangüíneo. As amostras de plasma sangüíneo foram processadas para que a corrida eletroforética em gel de poliacrilamida pudesse ser realizada. Para a coloraçäo do gel, usou-se Coomasie Brilliant Blue. Após análise dos padröes eletroforéticos da transferrina e albumina, observou-se que näo houve relaçäo detectável entre os fenótipos da albumina e precocidade sexual de touros doadores. Entretanto, em relaçäo à transferrina, foi possível sugerir uma associaçäo entre o alelo Tf elevado a D com touros portadores de sêmen congelável precocemente ou medianamente em termos de idade à congelaçäo